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11,20-二羰基济源冬凌草甲素及其L-氨基酸-14-酯三氟乙酸盐
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11,20-二羰基济源冬凌草甲素及其L-氨基酸-14-酯三氟乙酸盐 
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产品详情

本发明涉及11,20‑二羰基济源冬凌草甲素及其L‑氨基酸‑14‑酯三氟乙酸盐及其制备方法和用途,属药物化合物领域。其制备方法:以济源冬凌草甲素为原料,经琼斯试剂氧化,可得到11,20‑二羰基济源冬凌草甲素,其结构如下所示:再将其与N‑BOC‑L‑氨基酸发生14‑位酯化反应,得到N‑BOC‑L‑氨基酸‑11,20‑二羰基济源冬凌草甲素酯(III),然后在三氟乙酸中脱除BOC保护基,成盐得到L‑氨基酸‑14‑(11,20‑二羰基济源冬凌草甲素)酯三氟乙酸盐。其具有如下通式:该类化合物稳定性好,且具有抗肿瘤活性,为筛选食道癌、胃癌、原发性肝癌、胰腺癌、贲门癌、大肠癌、膀胱癌、乳腺癌以及急性髓系白血病等抗肿瘤药物提供基础。


权利要求书
1.11,20-二羰基济源冬凌草甲素,其特征在于,具有如下所示结构:
2.L-氨基酸-14-(11,20-二羰基济源冬凌草甲素)酯三氟乙酸盐类化合物,其特征在于,具有通式Ⅰ所示结构:
R为含有1-2个N、O或S杂原子的5-10元杂环烷基;或R为 其中R1为氢,直链或支链的C1-C10烷基或C1-C10直链或支链烷基取代的硫基、氨基取代的C1-C10烷基,苯基取代的C1-C5烷基;R’为氢或C1-C3烷基。
3.如权利要求2所述的L-氨基酸-14-(11,20-二羰基济源冬凌草甲素)酯三氟乙酸盐类化合物,其特征在于,R为含有1个N杂原子的5-6元杂环烷基;或R为 其中R’为氢或甲基,R1为氢或如下取代基之一:
4.如权利要求2所述的L-氨基酸-14-(11,20-二羰基济源冬凌草甲素)酯三氟乙酸盐类化合物,其特征在于,选如下化合物:
5.制备如权利要求2所述的L-氨基酸-14-(11,20-二羰基济源冬凌草甲素)酯三氟乙酸盐类化合物的方法,其特征在于,通过如下方法实现:
以化合物1为原料,丙酮为溶剂,搅拌溶解,随后在冰浴条件加入用丙酮稀释的Jones试剂,生成11,20-羰基济源冬凌草甲素(化合物2);
11,20-二羰基济源冬凌草甲素在二氯甲烷中,以EDCI(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐),DMAP(4-二甲氨基吡啶)和DIPEA(N,N-二异丙基乙胺)为催化剂,加入N-Boc-L-氨基酸反应,经过柱色谱纯化后制得N-Boc-L-氨基酸-14-(11,20-二羰基济源冬凌草甲素)酯类化合物(化合物3);
N-Boc-L-氨基酸-14-(11,20-二羰基济源冬凌草甲素)酯类化合物在二氯甲烷中冰浴,向体系中加入二氯甲烷:三氟乙酸1:1的混合溶液,冰浴搅拌反应;用薄层色谱确定反应完全后,旋蒸除去二氯甲烷和三氟乙酸,然后搅拌下加入异丙醚,得产物(化合物4)。
6.如权利要求1-4其中之一所述的11,20-二羰基济源冬凌草甲素及L-氨基酸-14-(11,20-二羰基济源冬凌草甲素)酯三氟乙酸盐类化合物在制备药物中的应用,其特征在于,以其为活性成份,制备治疗食道癌、胃癌、原发性肝癌、胰腺癌、贲门癌、大肠癌、膀胱癌、乳腺癌或急性髓系白血病药物。
说明书
11,20-二羰基济源冬凌草甲素及其L-氨基酸-14-酯三氟乙 酸盐
技术领域
本发明涉及药物化合物领域,具体涉及新型济源冬凌草甲素类化合物:11,20-二羰基济源冬凌草甲素及其L-氨基酸-14-酯三氟乙酸盐类化合物、制备方法及其应用。
背景技术
早在上世纪70年代,唇形科香茶菜属植物冬凌草良好的抗癌活性就引起了人们关注,冬凌草是河南省民间常用的中草药,经过药学工作者的长期研究,被证实有一定的抗肿瘤作用,而主要发挥抗肿瘤作用的是其中的二萜类化合物。济源冬凌草甲素是从冬凌草中提取出来的一种贝壳杉烯二萜类天然有机化合物,是抗肿瘤的主要活性成分之一。济源冬凌草甲素为本课题组首次从济源冬凌草中提取纯化出来的C-20被氧化的对映-贝壳杉烯二萜类化合物。在体外活性测试中发现其对EC-109细胞等多种肿瘤细胞显示良好的细胞毒活性。跟踪研究发现,在特定产地和生长时期在冬凌草叶中济源冬凌草甲素的含量高于冬凌草甲素,可达到5‰以上。
济源冬凌草甲素醛式与半缩醛式互变异构式
但是,济源冬凌草甲素是一个醛式和半缩醛式的平衡混合物,主要以半缩醛式存在,非常不稳定。济源冬凌草甲素口服生物利用度不足5%,不能达到有效的血药浓度;同时,它几乎不溶于水,采用静脉给药较为困难。对其结构进行修饰改造,改善其水溶性和活性,将其开发成为新的抗肿瘤药物,这是目前济源冬凌草甲素研究的重要方向。
发明内容
本发明目的在于提供一种新的对映贝壳杉烯型二萜化合物及该二萜化合物的系列衍生物;另一目的在于提供其制备方法及应用,为目前临床上抗癌药物筛选提供可能。
本发明以济源冬凌草甲素为原料,经琼斯试剂氧化,得到了其11,20位氧化产物11,20-二羰基济源冬凌草甲素,是一个新的对映贝壳杉烯型二萜,其结构如下所示:
为实现本发明目的,在获得的11,20-二羰基济源冬凌草甲素基础上对其结构进行修饰改造,获得了其L-氨基酸-14-酯三氟乙酸盐类化合物,其结构通式如下所示:
R为含有1-2个N、O或S杂原子的5-10元杂环烷基;或R为 其中R1为氢,直链或支链的C1-C10烷基或C1-C10直链或支链烷基取代的硫基、氨基取代的C1-C10烷基,苯基取代的C1-C5烷基;R’为氢或C1-C3烷基。
优选:R为含有1个N杂原子的5-6元杂环烷基;或R为
R’为氢或甲基,R1为氢、甲基或如下取代基之一:
为了制剂需要,本发明还需要进一步保护上述化合物可药用的盐,可接受的盐为有机酸盐、无机酸盐、有机碱盐或无机碱盐,其中有机酸包括乙酸、甲磺酸、柠檬酸、富马酸、马来酸、乙醇酸、乳酸、水杨酸、琥珀酸、对甲苯磺酸、酒石酸、甲磺酸、丙二酸、硫辛酸;无机酸包括,盐酸、氢溴酸、硝酸、硫酸、磷酸;有机碱包括葡甲胺、氨基葡萄糖;无机碱包括碱金属钠、钾、钡、钙、镁、锌的碱性化合物。
本发明提供了上述化合物的制备方法,通过以下反应路线合成:
(1)以济源冬凌草甲素(化合物1,缩写为JDA)为原料,丙酮为溶剂,在搅拌条件下使其全部溶解,随后在冰浴条件加入用丙酮稀释的Jones试剂,生成11,20-二羰基济源冬凌草甲素(化合物2,缩写为JDAO)。
(2)11,20-二羰基济源冬凌草甲素在二氯甲烷中,以EDCI(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐),DMAP(4-二甲氨基吡啶)和DIPEA(N,N-二异丙基乙胺)为催化剂,加入N-Boc-氨基酸反应,经过柱色谱纯化后制得N-Boc-L-氨基酸-14-(11,20-二羰基济源冬凌草甲素)酯类化合物(化合物3);
(3)N-Boc-L-氨基酸-14-(11,20-二羰基济源冬凌草甲素)酯类化合物在二氯甲烷中冰浴,向体系中加入二氯甲烷和三氟乙酸的混合溶液,冰浴搅拌反应。用薄层色谱确定反应完全后,旋蒸除去二氯甲烷和三氟乙酸,然后搅拌下加入异丙醚,析出大量白色固体,即为产物(化合物4)。
本发明优点及创新点在于:
1、济源冬凌草甲素本身稳定性较差,对济源冬凌草甲素部分基团进行修饰,11和20位羟基氧化成羰基,其稳定性大大提高,抗肿瘤活性同时也得到了增强,再与N-Boc-L-氨基酸酯化成盐,制备出济源冬凌草甲素类化合物,产物不仅水溶性良好,在大鼠和犬体内的转化率分别可达94.1%和128%。并而且该类化合物具有抗肿瘤活性,为筛选抗肿瘤药物提供基础。
2、路线制备方法简单易行,以济源冬凌草甲素为原料制备得初始原料,再经过修饰反应制得11和20位羟基氧化剂14位羟基氨基酸酯化的济源冬凌草甲素衍生物,收率达75%以上。
3、经药理毒理实验验证,该化合物不仅具有与11,20-二羰基济源冬凌草甲素相似的活性,而且在体外血浆及体内都能迅速转化为11,20-二羰基济源冬凌草甲素,发挥出11,20-二羰基济源冬凌草甲素的药效活性;毒性研究结果显示本品毒性较小,无遗传毒性的担忧;此外,本品克服了因使用非水刺激性溶媒造成静脉炎和特殊制剂引起过敏的副作用,家兔血管刺激性试验显示本品对血管无刺激性,豚鼠全身过敏试验也未见过敏现象,有效解决了济源冬凌草甲素成药的上述问题。
本发明合成的部分优选化合物的化学结构和核磁数据如下表1:
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步描述。
实施例1:
制备11,20-二羰基济源冬凌草甲素(化合物2,JDAO)
称取1g的济源冬凌草甲素(JDA),加入3.5mL丙酮使其溶解,冰浴搅拌下向体系中滴加适量琼斯试剂,反应约10分钟。用薄层色谱确定反应完全后,将体系用异丙醇稀释,并用旋蒸将溶剂蒸干。用50mL乙酸乙酯稀释后,水洗5次并反萃1次。合并酯层,用无水硫酸钠干燥1小时,旋蒸,得到JDAO(11,20-二羰基济源冬凌草甲素,化合物2)白色固体750mg,产率95%。
实施例2:
制备L-丙氨酸-14-(11,20-二羰基济源冬凌草甲素)酯三氟乙酸盐(化合物Ⅰ-1)
称取150mg JDAO,用2mL二氯甲烷溶解,常温搅拌下先后加入Boc-L-丙氨酸、EDCI(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)、DMAP(4-二甲氨基吡啶)和DIPEA(N,N-二异丙基乙胺)。反应1-2小时即可完全反应。用薄层色谱确定反应完全后,加入二氯甲烷30mL稀释反应体系,并用饱和氯化铵溶液对反应体系洗涤三次,合并水层后用二氯甲烷反萃一次。合并有机相,用无水硫酸钠干燥1小时,用柱色谱纯化。
将所得白色固体用二氯甲烷溶解,加冰浴。当体系温度降至5℃时,向体系中加入二氯甲烷:三氟乙酸1:1的混合溶液,冰浴搅拌20-30分钟。用薄层色谱确定反应完全后,旋蒸除去二氯甲烷和三氟乙酸,将体系浓缩成深黄色。然后搅拌下加入异丙醚,此时可析出大量白色固体,即为产物。搅拌1小时后,抽滤收集产物,用异丙醚洗涤后放入真空干燥箱干燥24小时。
实施例3:
制备L-缬氨酸-14-(11,20-二羰基济源冬凌草甲素)酯三氟乙酸盐(化合物I-2)
称取150mg JDAO,用2mL二氯甲烷溶解,常温搅拌下先后加入Boc-L-缬氨酸、EDCI、DMAP和DIPEA。反应1-2小时即可完全反应。用薄层色谱确定反应完全后,加入二氯甲烷30mL稀释反应体系,并用饱和氯化铵溶液对反应体系洗涤三次,合并水层后用二氯甲烷反萃一次。合并有机相,用无水硫酸钠干燥1小时,用柱色谱纯化。
将所得白色固体用二氯甲烷溶解,加冰浴。当体系温度降至5℃时,向体系中加入二氯甲烷:三氟乙酸1:1的混合溶液,冰浴搅拌20-30分钟。用薄层色谱确定反应完全后,旋蒸除去二氯甲烷和三氟乙酸,将体系浓缩成深黄色。然后搅拌下加入异丙醚,此时可析出大量白色固体,即为产物。搅拌1小时后,抽滤收集产物,用异丙醚洗涤后放入真空干燥箱干燥24小时。
实施例4:
制备L-苯丙氨酸-14-(11,20-二羰基济源冬凌草甲素)酯三氟乙酸盐(化合物I-3)
称取150mg JDAO,用2mL二氯甲烷溶解,常温搅拌下先后加入Boc-L-苯丙氨酸、EDCI、DMAP和DIPEA。反应1-2小时即可完全反应。用薄层色谱确定反应完全后,加入二氯甲烷30mL稀释反应体系,并用饱和氯化铵溶液对反应体系洗涤三次,合并水层后用二氯甲烷反萃一次。合并有机相,用无水硫酸钠干燥1小时,用柱色谱纯化。
将所得白色固体用二氯甲烷溶解,加冰浴。当体系温度降至5℃时,向体系中加入二氯甲烷:三氟乙酸1:1的混合溶液,冰浴搅拌20-30分钟。用薄层色谱确定反应完全后,旋蒸除去二氯甲烷和三氟乙酸,将体系浓缩成深黄色。然后搅拌下加入异丙醚,此时可析出大量白色固体,即为产物。搅拌1小时后,抽滤收集产物,用异丙醚洗涤后放入真空干燥箱干燥24小时。
按照上述方法依次合成化合物I4-I16。
实施例5:
本发明合成的目标化合物对人胃癌细胞MGC-803、HGC-27、SGC-7901和人前列腺癌细胞PC-3两种肿瘤细胞系进行了活性实验,实验结果显示衍生物有一定的抗肿瘤活性。
(一)实验方法:
(1)1640培养液的配制:在无菌条件下,取适量的无血清RPMI1640培养基,加到10%的胎牛血清中后摇晃均匀;然后再加双抗(链霉素100μg/mL和青霉素100μg/mL)后摇晃均匀。放置冰箱中保持4℃下备用。
(2)PBS缓冲盐的配制:称取1.56g Na2HPO4,0.2g KH2PO4,0.2g KCl,8.0g NaCl,称取后溶于950mL超纯水中,用干净玻璃棒搅拌溶解,然后再加超纯水定容直至1000mL。放置于干净的输液瓶中,在瓶塞上插入针头,在121℃高温高压下灭菌20min后冷却,放置于冰箱中保持4℃备用。
(3)铺板:将1640培养液、胰酶和PBS在37℃水浴锅中预热。长满细胞的培养瓶中的培养液弃去,用PBS清洗两次,加入1mL胰酶,轻轻摇晃混匀,放入培养箱1min。细胞消化完后及时加入2mL培养液,用吸管将细胞打成悬液,转移至离心管离心,弃去离心后的上清液,加入1mL 1640培养液混匀,继续加至2mL,充分混匀。取少量细胞悬液至计数板进行计数,得细胞总数。根据每孔所需铺的细胞数和铺板的板数计算所需细胞数量和细胞悬液的体积。取细胞悬液,加入到96孔板中,每孔100μL,加完后轻轻晃动使细胞混匀,放入培养箱培养24h,使细胞贴壁。
(4)加药:将待测药物用DMSO配制成104μmol/mL原药液,加药时取104μmol/mL的原药液配成9个浓度梯度,分别为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5μmol/mL,浓度由高到低,每孔均加200μL,每个浓度设3个复孔;阴性对照组需加200μL培养基,加完药后放入培养箱中培养72h,之后加入5mg/mL MTT,20μL/孔,继续培养4h-6h后将孔板中的上清弃去,加入DMSO,150μL/孔,在摇床中振摇10min,在酶联免疫检测仪上测490nm时的吸光度值,通过SPSS统计软件计算IC50值。
(二)实验数据及结果
本发明对上述合成的化合物抗肿瘤活性数据见表2
表2系列目标化合物对两种肿瘤细胞的药理活性(IC50)
JDAO为11,20-二羰基济源冬凌草甲素
Oridonin为冬凌草甲素
(三)结论
上述实验结果表明本发明所述化合物具有较好的体外抗肿瘤活性,为筛选食道癌、胃癌、原发性肝癌、胰腺癌、贲门癌、大肠癌、膀胱癌、乳腺癌以及急性髓系白血病等抗肿瘤药物提供基础。该类化合物稳定性好,以本发明化合物作为活性成分用于制备新的抗癌药物,具有潜在的应用价值。